PCR那点事

       PCR (Polymerase Chain Reaction)，中文翻译为聚合酶链式反应，是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，它可看作是生物体外的特殊DNA复制。 由1983年美国Mullis首先提出设想，1985年由其发明了聚合酶链反应，即简易DNA扩增法，意味着PCR技术的真正诞生。到如今，PCR技术已广泛应用于生命科学、医学研究、遗传工程、法医学、考古学、人类学等领域。

PCR原理
        PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，双链DNA解离，成为单链；②模板DNA与引物的退火（复性）：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在72℃、DNA聚合酶（如TaqDNA聚合酶）的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对原则，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链，重复此过程就可获得更多的“半保留复制链”。

PCR引物设计基本原则
①引物长度：15-30bp，常用为20bp左右。
②引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C 过多易出现非特异条带。
③两个引物之间不应存在互补序列，尤其是避免3'端的互补重叠。
④引物与非特异扩增区的序列的同源性不要超过70%，引物3′末端连续8个碱基在待扩增区以外不能有完全互补序列，否则易导致非特异性扩增。
⑤引物的5'端可以修饰。如附加限制酶位点，引入突变位点，用生物素、荧光物质、地高辛标记，加入其它短序列，包括起始密码子、终止密码子等。

PCR反应特点
特异性强
简便灵敏
纯度要求低

常见问题与解答
1、Q: 不出现扩增条带？
A: 在酶和引物质量好时，不出现扩增带，极有可能是标本的消化处理，模板核酸提取过程出了毛病。例如，模板中含有杂蛋白质，在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。因而要配制有效而稳定的消化处理液，其程序亦不宜随意更改。
2、Q: 出现的PCR扩增条带与目的靶序列条带一致，但其条带更整齐，亮度更高（假阳性）。
A: 出现假阳性的原因有：①引物设计不合适：选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性，在进行PCR扩增时，扩增出的PCR产物为非目的性的序列。因此，需重新设计引物。②靶序列或扩增产物的交叉污染。这种假阳性可用以下方法解决：操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及样进枪头等均应一次性使用。
3、Q: 出现非特异性扩增条带？
A: 非特异性条带的出现，其原因：一是引物与靶序列不完全互补、或引物聚合形成二聚体。二是Mg²⁺离子浓度过高、退火温度过低，及PCR循环次数过多有关。三是酶的质和量，酶量过多有时也会出现非特异性扩增。其对策有：必要时重新设计引物。减低酶量或调换另一来源的酶。降低引物量，适当增加模板量，减少循环次数。
4、Q: 出现片状拖带或涂抹带？
A: 其原因往往由于酶量过多或酶的质量差，dNTP浓度过高，Mg²⁺浓度过高，退火温度过低，循环次数过多引起。其对策有：①减少酶量，或调换另一来源的酶。②减少dNTP的浓度，适当降低Mg2+浓度。③增加模板量，减少循环次数。